鄭氏家廟創建於明永曆17年（1663），原為嗣子鄭經所建，奉祀鄭成功的專祠，係臺灣第一座鄭氏家廟。清康熙23年（1684）臺灣入清版圖以後，改稱「鄭氏大宗祠」，又稱「昭格堂」。堂內石柱聯曰「昭毅無雙開疆復土承天績，格思靡既迪後光前擘海祠」，尤顯延平拓土的功業與慎終追遠的美德。近年重修，改稱「鄭姓宗祠」；民國91年（2002）4月29日更予以正名，掛匾改稱「鄭成功祖廟」。

鄭氏家廟為三開間三進的閩南式傳統建築，正堂奉祀鄭成功塑像，神態威武有神，係府城妝佛世家「西佛國」第二代老師傅蔡心所製；清乾隆36年（1771）「三圭世錫」匾額高懸，三代爵位世襲，倍加尊崇。左神龕供奉「唐始祖鳳翔節度使進大司空同平章事臺文鄭公神主」、「宋始祖大司成閎中鄭公神位」與「明招討大將軍延平郡王大木鄭公暨配夫人董氏神位」，右神龕供奉清代鄭氏先賢三牌位，呈現宗廟的莊嚴肅穆。

在鄭氏家廟頭屋前庭右前方鑿有水井一口，係建廟時所開鑿的水井，井深約360公分，井口直徑138公分，為臺灣早期大口徑水井的特色。日治時期家廟前庭空地被鄭姓族人起造樓房，水井遂被湮滅。民國72年（1983）臺南市政府依都市計畫拓寬忠義路，拆除祠前樓房為騎樓用地，古井得以重現。目前以玻璃覆蓋以維安全，卻是水氣不散，蕨類茂生。