國立臺南第二高級中學創立於西元1914年(大正3年)5月11日,原名「臺灣總督府臺南中學校」,為日治時代臺灣中南部最先設立之中學,且主要設定為日籍青年就讀,首任校長廣江萬次郎。西元1922年(大正11年),更名為「臺南州立臺南第一中學」。1945年(昭和20年)二戰結束,日治時代終結,總計本校畢業班計五年制27屆及四年制1屆,共有畢業生日本籍2528名、臺灣籍320名。
臺灣光復後,1945年(民國34年)12月5日奉令改為「臺灣省立臺南第二中學」,於12月8日正式接收,因而定此日為學校校慶日。當時因國軍駐在本校,乃向省立臺南女中商借部份校舍臨時辦公,且因日籍員送回國,僅餘少數臺籍學生,奉令將其編入省立臺南第一中學,實際校務陷於停頓。
1946年(民國35年)9月6日恢復上課。學制上由四年制中學改制為三年制,成為三三制完全中學,招收男生。姜子榮校長任內填詞創作校歌,委由陸華柏先生作曲。
民國42年9月,學校奉准設立山地補習班,招收國校(小學)男女畢業生。同年12月8日,學校校刊「南二中青年」創刊號發行。民國44年7月3日因配合政府戰時特殊政策,奉准籌建聯合臺南一中、臺南女中之分校,地點選在臺南縣善化鎮,男女兼收。民國45年聯合分部獨立,改為省立善化中學。又學校特於臺南縣永康鄉設立分校,專收初中男生。
民國50年8月政府推行「省辦高中,縣(市)辦初中」,學校奉命專辦高中。
民國59年為實施九年國民義務教育,初中停招,同年8月1日學校更名為「臺灣省立臺南第二高級中學」。
民國77年8月1日,奉准設立美術實驗班,為中南部第一所實施美術資優教育的學校。
民國85年配合成功大學資訊系統,成為全省省中第一所連接上臺灣學術網路的學校,86年起擔任臺灣省高級中學推展資訊教育重點學校。民國87年完成藝能大樓興建。民國89年學校校名改為「國立臺南第二高級中學」,同年主辦全省高中聯招總闈場工作。
104學年度起普通班招生1/3女生。
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