1865年（清同治四年）馬雅各醫師奉英國長老教會派遣來臺宣教，起初開設醫館和禮拜堂於臺南看西街，不到一個月即因暴民抗爭而南遷打狗。1868年（清同治七年）底馬雅各回到府城，隔年一月在二老口租用三落的「許厝」，第一落為醫館，第二落設禮拜堂，並成立「傳道者速成班」培養在地佈道人才。 1875年（清光緒元年）甘為霖牧師在西竹圍籌建的宿舍「新樓」落成，設立「傳教師養成班」，府城東門附近地區逐步發展為在臺的宣教和教育基地。1876年（清光緒二年）長老教會合併臺南、旗后兩地的「傳教師養成班」，於二老口醫館創設臺南神學院的前身「大學」，第一任校長為巴克禮牧師。1878年（清光緒四年）「臺南教士會」議決在「新樓」旁增建教室與宿舍，1880年（清光緒六年）竣工後「大學」乃自二老口遷往西竹圍，其位址即今日神學院北校區。 日治初期校務發展蓬勃，「大學」校舍不敷使用，巴克禮牧師於1901年（明治三十四年）返回英國募款，隔年購得「新樓」南側土地展開建設。1903年（明治三十八年）舍落成於南校區，一樓設教室和禮拜堂，二樓做為學生宿舍，此即為「本館」，至此形成南、北兩校區的規模。1913年（大正二年）「大學」改名「臺南神學校」並持續運作。1925年（大正十四年）滿雄才牧師繼任校長。1940年（昭和十五年）曾因政治過度干預校務而關閉學校。 1948年（民國三十七年）復校，更名「臺南神學院」，滿雄才牧師回任校長，翌年退休，由黃彰輝牧師接任。1952年（民國四十一年）起獲得美國金陵基金會襄助，於南校區展開一系列建設，由時任副校長的安慕理牧師負責設計；1956年（民國四十五年）本館完成整修，全棟改為教室使用；另在本館南側設置十字花園、新建西校舍和禮拜堂，翌年落成，呈現三棟建築環繞十字花園之空間景觀。 1960至1980年（民國四十九年至民國六十九年）代，學校獲得不少國內外捐助，陸續於北校區興建神學研究院、音樂館、院長宿舍、教授宿舍群、頌音堂等建築物，原有19世紀的紅磚洋樓多拆除或改建。因此，南校園的本館、西校舍和禮拜堂等建築群以及十字花園，乃成為自1960年（民國四十九年）代以來，臺南神學院最具歷史意義和宗教象徵之校園地標。